Publications scientifiques

Identification et caractérisation des anomalies de méthylation sur génome entier chez les hommes infertiles.
Date de parution: 03/01/2012

Identification et caractérisation des anomalies de méthylation sur génome entier chez les hommes infertiles

Montjean D^1,2,5 Cohen-Bacrie P⁵, Benkhalifa M⁵, Siffroi JP ^2,4, Mandelbaum J³, Berthaut I³, Bashamboo A¹, McElreavey K, Ravel C^2,3.
¹Institut Pasteur, Unité de Génétique du Développement Humain, Paris, ²UPMC, ³AP-HP, Hôpital Tenon, Service d’Histologie-Biologie de la Reproduction, Paris ⁴AP-HP, hôpital Armand Trousseau, service de génétique et embryologie médicales, ⁵Laboratoire d'Eylau, Unilabs, Paris, France.

Introduction :
Une augmention des anomalies de l’empreinte a été rapportée chez les enfants issus de l’Assistance Médicale à la Procréation.
Or des anomalies de méthylation pourraient être impliquées dans des défauts de spermatogenèse et certaines anomalies de développement des cellules germinales mâles pourraient être dues à des modifica8ons épigénétiques normales.
Les facteurs épigénétiques et leurs modifications commencent actuellement à être explorés chez les individus infertiles. Il a été montré que l’oligozoospermie pourrait être associée à la survenue d’un défaut de méthylation mais les études sont restreintes  à l’étude de quelques loci.
Nous avons étudié ces anomalies de méthyla8on sur génome entier dans les spermatozoïdes d’hommes présentant une altération de la spermatogénèse.

Matériels - Méthodes :
Cette étude a été réalisée dans le cadre du PHRC Methylhomme, AOR08027.
Patients : hommes âgés de 18 à 45 ans présentant une oligozoospermie idiopathique inférieure à 20 millions de spermatozoïdes/ml consultant pour infertilité.

Les paramètres spermatiques ont été déterminés selon les normes de l’OMS (1999).
Analyses de méthylation de l’ADN spermatique : Les éjaculats ont été obtenus après 3 à 6 jours d’abstinence.
Les échantillons de sperme ont été débarrassés du plasma séminal ainsi que d’éventuelles cellules contaminantes par un gradient de densité.
Analyse du gène H19 : La conversion au bisulfite a été réalisée sur l’ADN génomique extrait des spermatozoïdes suivant les recommandations du fournisseur du kit Epitect® Bisulfite (Qiagen).
Le profil de méthylation du gène H19 a été étudié par PCR puis clonage.
Pour chaque patient, plus de 50 clones ont été lus.
Analyse sur génome entier : Les profils de méthylation des régions promotrices du génome entier ont été étudiés dans les spermatozoïdes portant une anomalie de méthylation dans le gène H19.
Cette analyse a été réalisée par MeDIP (Methyl - DNA Immunoprecipitation) suivi d’une hybridation sur puce pangénomique. (ImaGENES Roche NimbleGen).

Résultats :
119 pa8ents normospermiques, 116 pa8ents oligozoospermes modérés (numéra8on >5 M/ml) et 59 pa8ents oligozoospermes sévères (numération <5 M/ml ) ont été inclus dans l ’étude.
Une hypométhylation du gène H19 a été retrouvée chez 13,8% des oligozoospermes modérés et chez 32% des oligozoospermes sévères  (p<0.01) (Tableau 1).
Parmi les patients présentant une anomalie de méthylation, trois patients présentant le profil le plus altéré ont été sélectionnés pour analyse de méthylation pangénomique sur puces MeDIP (28 266 CpG) en comparaison à trois pa8ents normospermiques.
Le niveau de méthylation globale dans les spermatozoïdes de ces individus est 8.1%  plus élevé que celui des hommes normospermiques fertiles (p<0.001) (Figure 1).
Parmi les gènes anormalement méthylés, nous avons identifié plusieurs gènes soumis à empreinte parentale (DIRAS3, PLAGL1, IGF2R, SLC22A2, SLC22A3, DLGAP2, KNCK9, INPP5F, H19, SLC22A18AS, PHLDA2, MEG3 and NDN) (Tableau 2) ainsi que des gènes potentiellement impliqués dans la spermatogénèse (BRDT, DAZL, TRIP13, SPZ1, SYCP3) et dans le développement de cancers testiculaires (CHRNE FLT1, PDPN, PTEN, RARA).

Conclusions :
Le gène H19 a une expression maternelle et est normalement hyperméthylé chez l’homme.
Des anomalies de méthylation de ce gène H19 sont retrouvées chez les patients infertiles, avec une fréquence d'autant plus élevé que l’oligozoospermie est sévère.
Dans notre étude, un 8ers des patients porteurs d’une oligozoospermie sévère présente des anomalies de méthylation du gène H19.
Nous avons montré que les anomalies de méthylation du gène H19 retrouvées chez les patients oligozoospermes ne sont pas limitées aux gènes soumis à empreinte mais affectent en réalité la totalité du génome.
D’autres études sont nécessaires pour préciser l’impact de ces modifications sur la descendance.